組織甘油檢測試劑盒樣本處理方法

甘油是 甘油三酯 的 水解 產(chǎn)物。 與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解 反應(yīng) 的可靠檢測指標(biāo) ，但檢測更加方便 。 本 試劑盒采用優(yōu)化 步驟，能夠檢測實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油含量，線性范圍為10---1200 μ mol/L 。

原理：

在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油， 再被甘油磷酸氧化酶氧化 產(chǎn)生*；在過氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密 度值與甘油濃度成正比。

適用范圍：

測定 實(shí)體 組織 、 細(xì)胞中的甘油濃度。

一 組織細(xì)胞裂解

細(xì)胞（包括分化的脂肪細(xì)胞） 裂解：

消化、離心收集細(xì)胞。或直接在培養(yǎng)皿內(nèi)裂解。通常 6 孔板單孔約 2x10 6 個細(xì)胞， 75cm 2 瓶約 1x10 7

細(xì)胞。按比例每 1~2 x 10 6 細(xì)胞 加 0 .1ml 裂解液震蕩或渦旋裂解后 ，靜置 10 分鐘。

動物組織裂解：

切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進(jìn)行保存。組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切、稱重可能會產(chǎn)生嚴(yán)重的測量誤差。離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減即減量稱重法 計(jì)算組織重量 約 100mg) 。強(qiáng)烈建議按比例每 1mg 組織加10μl 裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。（ 注意：裂解液用量在 1ml 或更多可保證有效的裂解與脂取）。用電動高速勻漿器或手動玻璃勻漿器破碎組織。（不超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量），而后，靜置 10 分鐘。

二  裂解液處理：

1. 取適量上清液轉(zhuǎn)移到 1.5ml 離心管中 進(jìn)行步驟 2 的操作。余下的裂解液可用BCA 法蛋白定量試劑盒 P1511 進(jìn)行蛋白定量或-20℃ 儲存。

2. 70℃ 加熱 10 分鐘滅活脂肪酶，可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

3. 室溫 5000 rpm 離心 5 分鐘 ，上層 清液 即可用于酶學(xué)測定。

三 工作溶液 配制：

按 4 :1 比例 取 4 ml 試劑 R1 與1 ml 試劑 R2 混合 即可， 立即使用或 4℃ 保存<1 天，變色棄去 。 （注意：謹(jǐn)防來源不明但容易發(fā)生的甘油污染，可來自操作者本人或標(biāo)準(zhǔn)品液體微粒濺射等。）

四 標(biāo)準(zhǔn) 品稀釋

用蒸餾水 生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體 ，將 4 mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000 、 500 、 250 、 125 、 62.5 、 31.25、 15.625 、 7.8125μ mol/L 通常取其中 4~6 管即可，注意設(shè)置 0 濃度對照反應(yīng)管 。

五甘油測定

1. 參見下表加樣 。待測樣品體積 10 μl ，多加可能會抑制反應(yīng)。

2. 37℃或 25℃反應(yīng) 10 分鐘。 反應(yīng)平衡后顏色在60 分鐘 內(nèi)穩(wěn)定。

3. 先用蒸餾水 工作液的空白管調(diào)零，然后 測定各管OD 值 。

4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度 。

附Excel 作圖步驟 ：各標(biāo)準(zhǔn)管 OD 值為 y 軸，標(biāo)準(zhǔn) 品 濃度為 x 軸 。 ( 鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)Вx擇 散點(diǎn)圖 --，點(diǎn)擊 完成 。 ( 鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上 的某 一點(diǎn)，點(diǎn)擊 添加趨勢線 --，點(diǎn)擊 選項(xiàng) --，點(diǎn)擊 顯示公 式 和 R 2 值 。

5. 以每 mg 蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正甘油含量。