明膠酶譜法MMP2/MMP9檢測試劑盒注意事項

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高于ELISA方法，其基本原理1 和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結束后 取出凝膠與酶反應Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景， 但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區域，從而能 同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學 反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑 盒可進行50次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。

注意事項：

1.制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。

2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH好在7.5-7.6，復性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培養箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6、細胞樣本用PBS 5倍體積震蕩裂解,估算細胞的體積，然后加入5倍體積的PBS，渦旋振蕩15-30s,而后靜置或低速離心.或者手動震蕩。

7、組織或者細胞的話可以用PBS，可以用低滲溶液如三分之一或者四分之一的生理鹽水按照5倍體積加入后震蕩裂解細胞，離心即可，步驟和提蛋白很相似即可,其實重點的步驟主要是采用低滲裂解液進行裂解，組織的話可以勻漿20-30次，然后10000轉左右離心，5分鐘取上清即可

關于40左右出現的條帶，確實是我們好多客戶實驗過程中都會出現的，像什么Hela細胞、肝癌細胞、巨噬細胞等。還是之前給您解釋的，這個和細胞類型及明膠酶家族種類是有關系的；另外由于明膠酶譜的蛋白樣品是不*變性的，因為并沒有煮沸的過程，所以可能由于變性不充分的原因導致其分子量部位不同。我們也有好多客戶做檢測的時候會制備一個上樣的濃度梯度，下面給您附一個近一個客戶一次實驗的結果。他的在40左右也是出了條帶的。