酶聯免疫吸附試驗(enayme liked immunosorbent,ELISA)是20世紀70年代發展起來的一種檢測技術,因其具有敏感性高、特異性強、操作簡單等優點,被廣泛應用于各種抗原和抗體的測定,為輔助診斷與生物科研起到了積極的作用。但在ELISA的測定過程中,影響其測定結果的因素較多,操作過程每個環節都會對試驗結果產生影響,導致錯誤的測定結果。

1試劑的準備

　　目前各種ELISA試驗均有商品化的試劑盒。應選擇質量優良、有批準文號且在有效期內的檢測試劑，嚴格按照試劑說明書進行實際操作。從冰箱中取出的試劑應放在室溫下或37℃平衡30min再進行測試。保存試劑盒的冰箱應經常檢查儲存溫度并做好記錄，冰箱應避免頻繁開關。試劑使用前應搖勻。

　　2標本的采集和保存

　　ELISA試驗所用標本主要為血清，也可以用經過預處理的唾液、尿液、糞便等生物材料。患者標本可能含有干擾試驗的免疫物質，導致假陽性或者假陰性的結果，干擾因素一般可分為兩類，即內源性和外源性干擾因素。內源性干擾因素包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白等，避免內源性干擾因素主要通過選擇合理的試劑。外源性干擾因素包括標本溶血、標本被細菌污染、儲存時間過長及標本凝固等。在血液采集和運輸過程時，應注意避免溶血[1]。否則，紅細胞溶解時會釋放出血紅蛋白，血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有過氧化物酶活性的物質，在以HRP為標記的ELISA試驗測定中，可能會增加非特異性顯色而出現假陽性結果。血清標本適宜在新鮮時檢測，若推遲檢測需將標本低溫保存。一般說來，在7天內檢測的血清標本，可放置于2℃~8℃保存，超過1周檢測的需低溫冰存。因反復冰融會使抗體效價降低，所以，對需要保存做多次抗體測定的血清標本，應少量分裝并冰存。血清標本應充分離心，否則可因殘留的纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結果。

　　3加樣在ELISA試驗

　　操作中，依次有3次加樣，即加標本、加酶結合物、加底物。加標本一般采用手工加樣或者加樣器。手工加樣每次必須更換吸嘴，以避免交叉感染。要掌握好并在實際操作中揣摩使用技巧，避免吸樣量過多或過少。加樣器在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內附著的血痂等原因造成加樣不準，因此必須定期對加樣器進行維護和校準。加酶結合物和底物一般可直接滴加。每次加樣時，應將所加物置于ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，注意不可濺出，不能產生氣泡，加酶試劑后要用吸水紙在酶標板上輕輕擦拭吸干。加底物操作時應注意各試劑盒顯色劑不能混用，添加順序不能顛倒，不能濺出孔外。標本較多時，需要分批操作，以免加樣板過多，造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(尤其是在室溫較高時)。zui后，在微型振蕩器上震蕩lmin，以保證混勻。

　　4溫育

　　ELISA反應是抗原、抗體的結合在固相表面上發生的一系列的反應，抗原抗體結合是一個逐步平衡的過程，需要經過擴散才能達到反應的終點，因此ELISA反應需要一定時間的溫育。溫育也是影響檢測結果的關鍵因素，尤其是對弱陽性標本影響zui為明顯[2]。溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好地解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結果的吸光度差異(即“邊緣效應”)。溫育常采用的溫度是43℃、37℃、室溫和4℃，其中zui常用的是37℃，也是大多數抗原抗體反應的適合溫度。為了保證各板的溫度能迅速平衡，可將反應板放在水浴箱中，漂浮在水面上，但反應板不應疊放。為避免標本或稀釋液蒸發而吸附于孔壁，反應板應加蓋或貼封紙。注意溫育的溫度和時間，應按規定力求準確無誤。因為孵育時間過長，可以出現非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗*，導致花板。

　　5洗滌

　　洗滌是ELISA不同于均相免疫學檢測技術的一大特征，洗滌在整個ELISA反應過程雖不是一個反應步驟卻非常關鍵。操作者應嚴格按照要求洗滌，因為ELISA試驗就是依靠洗滌來達到分離游離的酶標記物和結合的酶標記物的目的。通過洗滌，可以清除殘留在板孔中沒有與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。采用自動洗板機洗板，洗板機設置時間、間隔、次數要保持一致，不能過多或過少。洗板次數較少，造成殘留，引起假陽性結果。洗板次數過多，可造成抗原抗體結合物洗脫，造成假陰性結果[3]。要保證洗液注滿各孔，防止在反應孔中形成氣泡而造成洗滌不充分。洗板結束后，在干凈無塵的吸水紙上輕輕拍干。如洗液量不足可致洗板不*，洗板針堵塞，抽吸不*，洗板不暢，導致洗板效果差。

　　6顯色

　　顯色是ELISA試驗中zui后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。適當提高溫度，有助于加速顯色。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。在定量檢測中，加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。ELISA顯色結果通過酶標儀進行，可減少實驗誤差，提高臨界值樣本的分析準確度。盡量避免肉眼直接判斷結果，因為不同個體的視覺存在差異。應注意，加顯色劑時，要保持顯色劑不外流。加終止液時應避免產生較多氣泡，否則可能使假陽性結果的出現概率增加。

　　7比色

　　比色的方法有目視法和酶標比色法2種。目視法簡單明了，但對同一標本，操作者的不同有時會出現不同的結果，具有一定的主觀性。比色的結果通常用光密度表達，現按規定用吸光度表達。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時的適宜室溫在15℃~30℃之間，使用前要先預熱儀器15~30min，使測得結果更為準確。比色前，應先用潔凈的吸水紙擦拭干凈板底附著的液體，然后將板正確放在酶標比色儀的比色架上。綜上所述，的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。在實際應用過程中，操作者必須熟練掌握基本操作技能，對每個環節進行嚴格仔細的核查，盡量避免假陽性和假陰性反應的出現，保證檢測結果真實可靠，為診斷和疾病防治提供可靠的理論依據。

 1.2 試劑的準備

在實驗室，對試劑的準備一般 不太注意，通常的做法是在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽 略了這種做法有可能影響后面時間不夠的問題，其直接的后果是對一 些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此，在ELISA 測定中試劑的準 備zui為關鍵的是，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20~ 30 min 后，再進行測定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的 目的能使反應微孔內的溫度較快地達到所需的溫度，以滿足后面的測 定需求。 樣本的因素

2.1 內源性干擾因素 包括類風濕因子、 補體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等。 2.1.1 類風濕因子在類風濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同 濃度的類風濕因子，其一般為IgM 型，亦有IgG 和IgA 型，具有與 變性IgG 產生非特異結合的特點，因為在ELISA 上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG 結合， 從而出現假陽性結果。避免其發生的方法有:用F2 替代完整的IgG。 標本用聯有熱變性IgG 的固相吸附劑處理。檢測抗原時，可用 2-巰基乙醇加入到標本稀釋液中使RF 降解。

2.1.2 補體在固相酶 免疫測定中，來自哺乳動物的固相抗體和酶標二抗均有激活人補體系 統的功能。一方面，固相抗體和酶標二抗可因其吸附及結合過程中抗 體分子發生變構，使Fc 段的補體C1q 結合點暴露出來，使C1q 成為 一個中介物將二者交聯起來出現假陽性結果。另一方面，固相抗體也 會因為活化補體的結合，封閉抗體和抗原的表位結合能力而引起假陰 性。解決的辦法是:用EDTA 稀釋標本。56 30 min 加熱血清 使C1q 2.2外源性干擾因素 包括標本溶血、標本被細菌污 染、標本保存時間過長和標本凝固不全等。 2.2.1 標本的溶血血紅 蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物 酶為標志的ELISA 測定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很 容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP 底物反應顯 色。所以在采血時應注意手法，采集的血液勿用力振蕩，嚴防標本溶血。